【金研动态】 浙江大学金华研究院肖庆全研究员团队开发紧凑型Cas9d基因编辑系统

DNA碱基编辑器（BEs）因不依赖DNA双链断裂和供体模板，即可实现精准碱基转换，已成为基因编辑领域的重要工具。然而，经典SpCas9核酸酶体积较大，基于SpCas9开发的编辑系统难以通过单个AAV载体进行递送，严重阻碍了其在体内的应用。近年报道的微型基因编辑系统（如IscB）虽尺寸较小，但因间隔序列过短且TAM序列较长，存在脱靶位点增多、有效靶向范围受限等瓶颈。

近日，浙江大学金华研究院未来医药工坊项目团队顾臻教授、肖庆全研究员与西北农林科技大学魏迎辉教授、中科中山药物创新研究院李国玲副研究员等团队合作，在Advanced Science杂志发表了题为“Compact 9dBEs Enable Efficient and Precise Genome Editing in Mammalian Cells and In Vivo”的研究论文。该研究通过结构指导的理性设计，将II-D型紧凑Cas9系统（Cas9d）改造为高效、特异的Cas9d^Ultra系统，并基于此构建了相应的DNA碱基编辑器9dBEs。这些工具在小鼠受精卵中以及单AAV递送的体内应用中，均展现出可观的编辑效率和特异性。为单AAV递送的体内碱基编辑提供了重要技术支撑。

研究团队聚焦于来自Deltaproteobacteria宏基因组的II-D型Cas9同源蛋白——Cas9d（MG34-1）。该蛋白仅有747个氨基酸残基，使用与经典SpCas9相同的20nt间隔序列，并识别NGG PAM序列，在进化上被认为是微型OMEGA系统与大型Cas9系统之间的桥梁。之前的研究表明该蛋白在真核细胞中无核酸酶活性，因此能否将其开发用于哺乳动物细胞编辑始终是一个未解之谜。

鉴于该系统在靶向范围和尺寸上的明显优势，研究团队借助AlphaFold3预测了Cas9d-gRNA-dsDNA三元复合物的三维结构，并开展了理性改造。研究团队经过对gRNA支架和Cas9d蛋白关键结构域的系统性改进，将gRNA长度减少了25nt，得到gRNA-v3变体（110nt）。该变体与含有4个突变的Cas9d^Plus (V281R/G492R/M544R/D582R)组合，获得了高效率的Cas9d^Ultra系统。经全基因组无偏的GUIDE-seq方法检测，结果表明该系统具有较高的特异性。重要的是，gRNA-v3变体精简的组成在满足批量工艺生产应用需求方面也具有显著优势，为基于LNP递送的规模化应用奠定了重要基础。在基因编辑领域，CBE系统的单AAV递送一直是一个重要难题。基于Cas9d^Ultra，研究团队开发了紧凑的腺嘌呤碱基编辑器（9dABE）和胞嘧啶碱基编辑器（9dCBE），并在小鼠胚胎中证明了Cas9d^Ultra和9dCBE的高效性和特异性。

图2. Cas9d^Ultra和9dBEs平台在小鼠胚胎及体内高效地实现基因编辑

高胆固醇血症以血液低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平显著升高为核心特征，而PCSK9基因作为LDL-C代谢的关键负调控因子，已成为该疾病的重要干预靶点。为验证9dBE系统在体内治疗的潜力，研究团队针对小鼠胆固醇代谢关键靶点Pcsk9基因，通过单AAV递送将9dABE或9dCBE注射至新生小鼠腹腔内。第5周的检测结果显示，9dABE在小鼠肝脏中的编辑效率为3.5%-11.9%，而9dCBE的平均编辑效率达15.7%（最高28.9%），且9dCBE显著降低了小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，从而证实了该CBE系统在体内编辑的有效性。

该研究将曾被报道缺乏真核活性的紧凑型Cas9d系统开发为高效、特异的基因编辑平台，并通过在小鼠胚胎中及单AAV递送的体内应用等实验，验证了其有效性和优势，为基础研究和体内应用提供了重要的新工具。目前，该研究相关的技术平台已获得国家专利授权（#ZL202610251120.1），为后续的深入研究和转化应用奠定了重要基础。

顾臻教授、肖庆全研究员、魏迎辉教授、李国玲副研究员为论文的共同通讯作者。我院肖庆全研究员、田之锦博士，浙江大学药学院翁璐琦博士、西北农林科技大学徐坤副教授、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）韩鼎毅博士为该论文共同第一作者。

该研究得到了国家自然科学基金、科技部重点研发计划、浙江省自然科学基金青年项目、金华市科技重点项目等资助。

原文链接：http://doi.org/10.1002/advs.77279

供稿|肖庆全

编辑|水盈盈

一审|毛 俊

二审|卢建红

终审|徐新民